Tumorselektive Einschleusung zytostatischer Chemotherapeutika durch sulfatierte Glykosaminoglykane (GAG)

Landsberger A., M. Landsberger

(veröffentlicht in: TW Gynäkologie 2, 307 - 314 (1989)

 

Kurzfassung

Durch Beobachtung des Wachstums tierexperimenteller Geschwülste wurden wir auf den tumorhemmenden Effekt des Granulainhaltes von Gewebsmastzellen aufmerksam. Wir untersuchten eine Fraktion der Inhaltsstoffe, die Glykosaminoglykansulfate (GAG), näher und stellten fest, dass diese Substanzen in der Lage sind, selektiv in Tumorzellen einzudringen und sogar andere Stoffe einzuschleusen. Kombinationen der GAG mit Zytostatika brachten in Tierversuchen sowohl bei autochthonen als auch transplantablen Tumoren jedesmal eine deutliche Wirkungsverbesserung gegenüber alleiniger Zytostatikaanwendung. Chondroitinpolysulfat, Dermatanpolysulfat und Pentosanpolysulfat scheinen die für den therapeutischen Einsatz geeignetsten GAG zu sein.

Erste klinische Einzelfalluntersuchungen zeigen, dass durch die Kombination mit dem GAG die Nebenwirkungen einer Chemotherapie stark gesenkt werden bei offenbar verstärkter Wirksamkeit. Kontrollierte klinische Studien bei verschiedenen Tumorarten sind in Vorbereitung.

Summary

Observing the growth of experimentally induced tumors on animals we realized that the granules of tissue mast cells were exerting a reducing effect on tumor growth. Therefore, we investigated a fraction of the mast cell content, namely the Glycosaminoglycan sulfates (GAG). It could be established that these substances are able to penetrate selectively into tumor cells, even to pass other substances in. In further experiments combinations of GAG and cytostatic drugs produced a significant better effect both at autochthons and transplantable tumors, compared with cytostatic drugs alone. Chondroitin polysulfate, Dermatanpolysulfate and Pentosan polysulfate seem to be the most appropriate GAG for therapeutic use.

Primary clinical single case investigations show that the combination with GAG reduces the side effects of a chemotherapy with a concomitant increase of effectivity. Controlled clinical studies, concerning different kinds of tumor, are being prepared.

 

Einleitung

In der internistischen Tumorbehandlung stellt die zytostatische Chemotherapie die derzeit wirksamste Möglichkeit dar. Leider schränken mehrere ungelöste Probleme ihre Anwendbarkeit und die damit erreichbaren Erfolge ein. Zum einen die teilweise schweren kurz-, mittel- und langfristigen Nebenwirkungen, zum anderen die Entwicklung von Resistenzen. Hinzu kommt, dass bei vielen Krebsarten besonders in fortgeschrittenen Stadien, selbst nach anfänglichen Remissionen keine Lebensverlängerung erzielt wird. Ein wesentlicher Grund dafür ist die mangelhafte Tumorselektivität aller bisher getesteten Substanzen.

Es scheint jedoch, dass diese Tumorselektivität durch bestimmte anionische Linearpolymere aus der Grundsubstanz der Bindegewebe deutlich gesteigert werden kann.

Ausgangsuntersuchungen:

Ziel der Untersuchungen, die zu den hier vorgestellten Ergebnissen geführt haben, war ursprünglich lediglich die genaue Beobachtung und Beschreibung der Entstehung und des Wachstums tierexperimenteller Geschwülste, wie sie Aufgabe des Morphologen ist.

Dabei stellten wir fest, dass benzpyren-induzierte Sarkome bei Ratten dann besonders langsam wuchsen, wenn im Tumorgewebe vermehrt Gewebsmastzellen auftraten (Die gleiche Beobachtung machte bereits Fromme 1907 [9, 19]). In den Regionen, wo Gewebsmastzellen ihre Granula ins Tumorgewebe abgegeben hatten, verloren die Tumorzellen ihre Anfärbbarkeit; Zeichen des Vitalitätsverlusts. Hauptinhaltsstoff dieser Granula ist neben Histamin ein Gemisch verschiedener, überwiegend sulfatierter ext. Glykosaminoglykane (GAG) [3].

 

Polymorphzelliges Sarkom der Ratte (benzpyreninduziert)
Färbung: Azur II Eosin

Vergr.: 480-fach


dichtes Zellbild, mit Teilungsfiguren, deutlich gefärbt


verminderte Anfärbbarkeit degenerativer Tumorzellen
bei vermehrtem Auftreten von Gewebsmastzellen

 

Aus der pathologisch-klinischen Erfahrung war bekannt, welche Bedeutung die Basalmembran, die ebenfalls GAG enthält, für die Begrenzung der Tumorausbreitung hat [3, 10]. Durch diese Übereinstimmung aufmerksam geworden, injizierten wir in darauffolgenden Versuchen verschiedene GAG direkt ins Tumorgewebe bzw. paratumoral. Wenn wir sulfatierte Vertreter dieser Stoffgruppe eingesetzt hatten, konnten wir beobachten, dass die Tumorzellen zerstört, das umgebende normale Bindegewebe jedoch nicht geschädigt wurde [16].

Bei der intravenösen oder intraperitonealen Injektion ergab sich die erstaunliche Tatsache, dass die GAG in den Tumorzellen histochemisch nachweisbar waren, nicht aber in normalen Gewebezellen, außer denen des retikulohistiozytären Systems (RHS).

 

Metachromatischer Nachweis eines GAG (Chondroitinpolysulfat, CPS) im Gewebe
nach intraperitonealer Injektion durch Färbung mit Azur II Eosin

CPS stellt sich rot dar


normales Lebergewebe der Ratte
nur die von Kupfferschen Sternzellen (Bestandteil des RHS) enthalten CPS,
die Leberzellen sind frei
Vergr.: 400-fach


polymorphzelliges Sarkom (autochthoner Tumor) der Ratte
hier ist CPS sowohl extra- als auch intrazellulär nachzuweisen
Vergr.: 600-fach

 

Damit stellte sich die Frage, ob durch die GAG auch andere Stoffe gezielt in die Tumorzelle eingebracht werden können. Stoffe, die sonst nicht oder nur in geringem Maße hineingelangen. Um dies zu klären, wählten wir den Farbstoff ext. Evans blue, der u.a. zur Messung des Plasmavolumens benutzt wird, weil er normalerweise nicht in Zellen eindringt und auch in hohen Dosen nicht toxisch ist. Für die histologische Auswertung, die wir vorhatten mußte jedoch berücksichtigt werden, dass die phagocytierenden Zellen des RHS den Farbstoff aufnehmen und speichern.

Wir bildeten zwei Gruppen mit jeweils fünf Ratten, die alle ein benzpyren-induziertes Sarkom von etwa Kirschgröße trugen und injizierten der ersten Gruppe zweimal im Abstand von 24 Stunden 30 mg Evans blue intraperitoneal. Die zweite Gruppe erhielt nach dem gleichen Schema 30 mg Evans blue zusammen mit 0,5 cm3 eines GAG. Weitere 24 Stunden später wurden den narkotisierten Tieren Leber, Milz, Lunge, Gehirn und Tumor entnommen und in Gefrierschnittechnik aufbereitet).

 

Anreicherung von Evans blue in verschiedenen Zelltypen
nach intraperitonealer Applikation beim Benzpyrensarkom der Ratte,
einmal ohne und einmal mit GAG

 

Tabelle 1 Parenchymzellen
(Leber, Milz, Lunge, Gehirn)
RHS-Zellen Tumorzellen
Cytoplasma Kern
1. Gruppe:
Evans blue
- ++ - -
2. Gruppe:
Evans blue + GAG
- ++ + ++

 

Bei keiner der beiden Tiergruppen fand sich Evans blue in den Parenchymzellen der untersuchten Organe. Die RHS-Zellen hatten den Farbstoff erwartungsgemäß aufgenommen. Die beiden Gruppen unterschieden sich jedoch deutlich in der Anfärbung der Tumorzellen. Nur bei der zweiten Gruppe, die Evans blue zusammen mit GAG erhalten hatte, enthielten die Tumorzellen den Farbstoff, schwerpunktmäßig im Kern, mit Betonung der Nukleolen [17].

 

Polymorphzelliges Sarkom der Ratte (benzpyreninduziert)
nach intraperitonealer Injektion des Farbstoffs Evans blue


ohne CPS
Vitalfärbung, Vergr.: 600-fach


mit CPS
die Blaufärbung der Tumorzellen zeigt, dass der Farbstoff in die Zellen gelangt,
wenn er zusammen mit dem GAG verabreicht wird
Vitalfärbung, Vergr.: 1000-fach

Überprüfung der Wirkung einer Kombination von GAG mit Zytostatika

Durch dieses Resultat ermutigt, begannen wir die therapeutische Wirkung einer Kombination von Zytostatika mit GAG in ausgedehnten Versuchsreihen an verschiedenen Tiermodellen zu überprüfen [18]. Wir wählten mit Cyclophosphamid (Endoxan), Methotrexat, Fluorouracil, Vincristin, Mitomycin, Doxorubicin (Adriblastin) und Cisplatin weit verbreitete Zytostatika unterschiedlicher Wirktypen. Dabei erwies sich die Kombination jedesmal dem alleine verabreichten Cytostatikum gegenüber als überlegen.

Als Beispiel ein Versuch mit Yoshida-Ascites-Sarkom.

Charakterisierung der verwendeten Substanzen

Während der Jahre, die diese Untersuchungen in Anspruch nahmen, wurde die Struktur der verschiedenen GAG aufgeklärt und ihre jeweiligen, spezifischen Eigenschaften dokumentiert. Da die Substanzen jetzt in relativ reiner Form darstellbar waren, verglichen wir sie auch miteinander, wie in dem angeführten Versuch. Es galt herauszufinden, welche Grundmerkmale ein Molekül aufweisen muß, um in unserem Ansatz wirksam zu sein, vor allem aber die für die klinische Anwendung geeignetsten Stoffe und ihre Dosierung zu ermitteln. Dies scheinen Chondroitinpolysulfat, Dermatanpolysulfat und Pentosanpolysulfat zu sein, letzteres besonders in Kombination mit einem der vorgenannten. Alle drei sind stark anionische Linearpolymere. Die ersten beiden setzensich aus Disaccharideinheiten zusammen, werden aus tierischen Geweben gewonnen und modifiziert. Pentosanpolysulfat besteht aus sulfatierten Pentosen und ist ein halbsynthetisches Produkt auf pflanzlicher Basis.

Den Sulfatgruppen kommt größte Bedeutung zu, da sich gezeigt hat, dass geringer sulfatierungsgrad die Wirkung stark herabsetzt. Der hohe Schwefelgehalt von ca. 14%, der über dem des natürlich vorkommenden Chondroitin- bzw. Dermatansulfat liegt, bewirkt unter anderem, dass die Substanzen von körpereigenen Enzymsystemen kaum abgebaut, sondern größtenteils unverändert ausgeschieden werden [25].

Das Molekülgewicht der Polymere ist abhängig von der Anzahl der Saccharide bzw. Disaccharideinheiten, die zwischen 8 und 50 schwankt. Wichtiger Vorteil des Chondroitin-, Dermatan- und Pentosanpolysulfats gegenüber dem Heparin ist die geringere Erhöhung der Blutungsneigung. Die vorhandene antikoagulämische Aktivität wirft bei den von uns verwendeten Dosierungen normalerweise keine Probleme auf.

Erste klinische Anwendung

Einige Glykosaminoglykansulfate, wie z.B. Heparin, werden seit langem in der Humanmedizin therapeutisch genutzt. Deshalb liegen bereits zahlreiche Informationen über die Pharmakodynamik, Pharmakokinetik und Toxizität dieser Stoffe vor. Die, besonders im Vergleich zu cytostatischen Chemotherapeutika, äußerst minimalen möglichen Nebenwirkungen erleichterten uns die Entscheidung, die neuartige Kombination auch klinnisch zu testen.

Die ersten Patienten waren ausbehandelte Fälle mit ausgedehnt metastasierten Tumoren. Dabei fiel sofort auf, dass die Chemotherapie mit Glykanpolysulfatzusatz ungewöhnlich gut vertragen wurde. Übelkeit und Erbrechen waren selten, stattdessen wurde meist der Appetit wieder angeregt; Haarausfall kam nicht vor, und die Leukozyten stiegen an, statt abzufallen.

Dies war jedoch nicht durch eine verminderte Wirksamkeit erkauft worden. Die klinischen Befunde sprechen viel eher für eine wesentliche Verstärkung der Chemotherapiewirkung. Oft besserte sich im Laufe von Tagen der Gesamtzustand und das subjektive Befinden. Auch in den Fällen, in denen eine vorhergehende normale Chemotherapie nicht mehr angesprochen hatte, konnten Remissionen nachgewiesen werden.

Zur Zeit werden Pilotstudien bei Mammakarzinom, Hodgkin und Non-Hodgkin eingeleitet.

Applikation und Dosierung

Die Kombination von Cytostatikum und Glykosaminoglykanpolysulfat wird durch einfaches Mischen hergestellt, sofern beide Substanzen zusammen löslich sind. Dies trifft für Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluorouracil, Vincristin und Mitomycin zu. Wenn es zur Ausfällung kommt, wie es bei Cisplatin und Doxorubicin der Fall ist, muß das Glykosaminoglykanpolysulfat in einer getrennten Spritze aufgezogen und etwa zwei Minuten vor der Zytostatikaverabreichung injiziert werden.

Die Mengenverhältnisse richten sich nach der Art der verwendeten Substanzen, der Art der Applikation und der Gesamtdosis.

Appliziert werden kann die Kombination sowohl intravenös, als auch intrapleural, intraperitoneal, para- oder intratumoral. Welchen dieser Wege man wählt, hängt von der Art, Lage und Größe des Tumors und vom Behandlungsziel ab.

Der Umfang der bisherigen Erfahrung läßt noch nicht die Angabe verbindlicher Dosierungen zu. Sicher ist, dass neue Schemata entwickelt werden müssen, um optimale Wirkung zu erreichen. Grundsätzlich können und sollten die Zytostatikadosen gesenkt werden, da der selektive Angriff auf die Geschwulst zu einem viel schnelleren Tumorabbau führt und zu hohe Zerfallsstoffkonzentrationen im Kreislauf vermieden werden müssen.

Diskussion

Zur Zeit liegen zwar noch keine Ergebnisse kontrollierter klinischer Studien vor, aber wir überblicken inzwischen etwa achzig Fälle, überwiegend epithelialer Tumoren, einige davon über mehrere Jahre. Diese weisen einheitlich darauf hin, dass durch die Kombination von Zytostatika mit Chondroitin-, Dermatan- oder Pentosanpolysulfat bisher übliche therapiebedingte Belastungen und Gefährdungen des Krebspatienten deutlich gesenkt werden können.

Darüberhinaus wurden zumeist eindrucksvolle Remissionen erzielt, sogar bei Patienten, die zuvor nicht auf eine Chemotherapie angesprochen hatten oder bei denen diese wegen Unverträglichkeit abgebrochen worden war. Außerdem fiel mehrfach auf, dass Zytostatika, für die die Tumoren resistent geworden waren, ihre Wirkung zurückerlangten.

Zur Erklärung des Verhaltens der Glykosaminoglykanpolysulfate und ihrer offensichtlichen Carrier-Funktion liegen bisher nur wenige Befunde vor. Bekannt ist, dass sie Enzymsysteme hemmen, die durch Abbau der extrazellulären Matrix invasives Tumorwachstum begünstigen [2, 23, 26, 27]. Möglicherweise werden durch die Glykanpolysulfate auch innerhalb der Tumorzellen Enzyme blockiert und so die Zytostatikawirkung ergänzt oder verstärkt.

Über Zeitpunkt und Mechanismus des Eindringens können wir nur sagen, dass er nicht an eine Teilungsphase gebunden zu sein scheint. Auszählungen im Rahmen der histologischen Untersuchungen ergaben, dass mehr Tumorzellen Glykosaminoglykanpolysulfat bzw. die damit zusammen verabreichte Substanz enthielten, als es ihrer Teilungsrate entsprach. Diese Beobachtung korreliert mit dem guten Ansprechen auch von Tumoren mit niedriger Teilungsrate.

Hinweis für die Annahme, dass die Tumorselektivität der sulfatierten Glykosaminoglykane auf Eigenschaften der Zellmembran beruht, könnte die Tatsache sein, dass die Fibronektine der Oberflächen normaler Zellen, die Kollagen, Fibrinogen, Heparansulfat, Heparin und Hyaluronsäure binden, keine spezifischen Bindungsstellen für Chondroitin- und Dermatansulfat aufweisen [14]. Welche Art von Verbindung die GAG mit den von ihnen transportierten Substanzen eingehen ist noch ungeklärt. Überrascht hat uns, wie verschiedenartig diese Stoffe sein können. Hier spielt sicherlich die Größe und die starke negative Ladung der Glykansulfatmoleküle eine Rolle.

Als Erläuterung zum Literaturverzeichnis muß angemerkt werden, dass die Stoffgruppe der GAG häufig auch als "saure Mukopolysaccharide" oder "Mukoitinschwefelsäure" bezeichnet wird [3, 13, 159]. Die Zuordnung, welche Stoffe dieser Gruppe angehören, ist nicht ganz einheitlich.

So ist Pentosanpolysulfat wegen des Fehlens der Aminogruppen streng genommen kein GAG. Aber wegen seiner sehr ähnlichen Eigenschaften, nicht nur in unserem Ansatz, haben wir es, wie einige andere Autoren, vereinfachend dazugerechnet.

Abschließend möchten wir noch einmal betonen, wie außerordentlich gering die Nebenwirkungen der GAG sind, so dass unserer Ansicht nach einer ausgedehnten klinischen Erprobung der hier vorgestellten Kombination nichts entgegensteht.

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